膽堿對(duì)于科研試劑中的應(yīng)用以及測(cè)定方法

膽堿是一種強(qiáng)有機(jī)堿，是卵磷脂的組成成分，也存在于神經(jīng)鞘磷脂之中，是機(jī)體可變甲基的一個(gè)來(lái)源而作用于合成甲基的產(chǎn)物，同時(shí)又是乙酰膽堿的前體。 膽堿對(duì)人體的作用相當(dāng)廣泛，如促進(jìn)腦發(fā)育和提高記憶能力、調(diào)控細(xì)胞凋亡、促進(jìn)脂肪代謝、促進(jìn)體內(nèi)甲基代謝、降低血清膽固醇等。因此，在乳品中添加膽堿越來(lái)越受到重視，世界許多國(guó)家，包括中國(guó)在內(nèi)，均已將膽堿批準(zhǔn)作為營(yíng)養(yǎng)食品添加劑。

信帆生物對(duì)質(zhì)量的控制涵蓋生物試劑、放行、市場(chǎng)質(zhì)量反饋的全過(guò)程,包括原輔料、包裝材料、工藝用水、中間過(guò)程及成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和分析方法的建立、取樣、檢驗(yàn)和產(chǎn)品穩(wěn)定性考察和市場(chǎng)不良反饋樣品的復(fù)核等工作,確保產(chǎn)品的經(jīng)確度、穩(wěn)定性。我們確保銷售給客戶的產(chǎn)品是能夠符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),適合客戶要求的產(chǎn)品。

國(guó)標(biāo)GB5413.20-2013嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定中規(guī)定了兩種方法，酶比色法和雷氏鹽分光光度法。鑒于目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法（雷氏鹽比色法）不同程度的存在操作繁瑣、選擇性差、干擾因素多等缺陷，一般大型企業(yè)都會(huì)選擇酶比色法。

二、膽堿的含量測(cè)定方法（酶比色法）

1、原理：膽堿經(jīng)酸水解后邊成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。

2、試劑

鹽酸（1mol/L）:量取85ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；

鹽酸（3mol/L）：量取125ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；

氫氧化鈉溶液（500g/L）：稱取500g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000ml；

Tris緩沖溶液（0.05mol/L，PH=8.0±0.2）：稱取6.057g三羥基氨基甲烷溶于500ml蒸餾水中，用1mol/L鹽酸調(diào)PH至8.0±0.2，用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在4℃冰箱可保存一個(gè)月；

酶反應(yīng)顯色劑：取100-120活力單位的膽堿氧化酶、250-280活力單位的過(guò)氧化物酶、75-100活力單位的磷脂酶D、15mg 4-氨基安替比林和50ml苯酚置于100ml的容量瓶中，用0.05mol/L Tris緩沖液稀釋至刻度。（現(xiàn)用現(xiàn)配）

膽堿氫氧化物標(biāo)準(zhǔn)品：稱取102±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523mg置于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度即為儲(chǔ)備液（冰箱冷藏不超過(guò)1周）；

吸取儲(chǔ)備液10.0ml溶液與100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度即為工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

3、簡(jiǎn)易步驟

3.1樣品制備：稱取5g混合均勻的固體樣品（液體20g），于100ml錐形瓶中，加入30ml1mol/L鹽酸溶液（液體樣品10ml 3mol/L鹽酸溶液）；70℃水浴，水解3小時(shí)（每隔半小時(shí)搖勻一次），冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH為3.5-4.0，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中用蒸餾水定容；過(guò)濾水解液，濾液應(yīng)是澄清，否則再慮，濾液放冰箱冷藏可保存3天。

3.2標(biāo)曲制作：分別吸取2ml、4ml、6ml、8ml膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作液于10ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度；準(zhǔn)備6支試管，一個(gè)做空白加入0.1ml蒸餾水，另5支分別加入0.1ml標(biāo)準(zhǔn)溶液和4個(gè)稀釋梯度，再每個(gè)試管加入3ml酶反應(yīng)顯色劑；用密封保護(hù)膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反應(yīng)15min；時(shí)間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長(zhǎng)505nm處，用蒸餾水做空白，測(cè)定吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.3樣品測(cè)定：將每個(gè)樣品準(zhǔn)備2支試管，分別加入0.1ml樣品濾液，一個(gè)加入蒸餾水3ml做空白，一個(gè)加入3ml酶反應(yīng)顯色劑；用密封保護(hù)膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反應(yīng)15min；時(shí)間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長(zhǎng)505nm處，用蒸餾水做空白，測(cè)定吸光值，然后計(jì)算樣品中膽堿的含量。